Ynterferinsjefaktoaren yn PCR-reaksjes

Tidens de PCR-reaksje wurde faak wat ynterferearjende faktoaren tsjinkommen.
Fanwegen de tige hege gefoelichheid fan PCR wurdt fersmoarging beskôge as ien fan 'e wichtichste faktoaren dy't PCR-resultaten beynfloedzje en kin falsk-positive resultaten produsearje.
Like kritysk binne de ferskate boarnen dy't liede ta falsk-negative resultaten. As ien of mear essensjele ûnderdielen fan it PCR-mingsel of de amplifikaasjereaksje sels wurde ynhibearre of fersteurd, kin de diagnostyske assay wurde hindere. Dit kin liede ta fermindere effisjinsje en sels falsk-negative resultaten.
Neist ynhibysje kin ferlies fan 'e yntegriteit fan it doelnukleïnezuur foarkomme fanwegen ferstjoer- en/of opslachomstannichheden foarôfgeand oan it tarieden fan it stekproef. Benammen hege temperatueren of ûnfoldwaande opslach kinne liede ta skea oan sellen en nukleïnesoeren. Sel- en weefselfixaasje en ynbêding fan paraffine binne bekende oarsaken fan DNA-fragmentaasje en in oanhâldend probleem (sjoch figueren 1 en 2). Yn dizze gefallen sille sels optimale isolaasje en suvering net helpe.

Figuer 1 | Effekt fan immobilisaasje op DNA-yntegriteit
Agarosegelelektroforese liet sjen dat de kwaliteit fan it DNA dat isolearre waard út paraffineseksjes fan autopsies flink fariearre. DNA fan ferskillende gemiddelde fragmintlengten wie oanwêzich yn 'e ekstrakten, ôfhinklik fan' e fiksaasjemetoade. DNA waard allinich bewarre bleaun as it fiksearre waard yn native beferzen samples en yn gebufferde neutrale formaline. It gebrûk fan in sterk soer Bouin-fixearmiddel of net-gebufferde, mierensoer-befetsjende formaline resultearre yn in signifikant ferlies fan DNA. De oerbleaune fraksje is tige fragmintearre.
Oan de linkerkant wurdt de lingte fan fragminten útdrukt yn kilobasepearen (kbp)

Figuer 2 | Ferlies fan yntegriteit fan nukleïnezuurdoelen
(a) In gat fan 3′-5′ op beide stringen sil resultearje yn in brek yn it doel-DNA. Synteze fan DNA sil noch altyd plakfine op it lytse fragmint. As lykwols in primer-annealingplak ûntbrekt op it DNA-fragmint, fynt allinich lineêre amplifikaasje plak. Yn it meast geunstige gefal kinne de fragminten inoar opnij verzadigje, mar de opbringsten sille lyts wêze en ûnder de deteksjenivo's.
(b) Ferlies fan basen, benammen troch depurinaasje en tymidine-dimeerfoarming, liedt ta in ôfname fan it oantal H-biningen en in ôfname fan Tm. Tidens de ferlingde opwaarmingsfaze sille de primers fan it matrix-DNA smelte en sille se net annealje, sels ûnder minder strange omstannichheden.
(c) Oangrinzgjende tyminebasen foarmje in TT-dimeer.
In oar faak foarkommend probleem dat faak foarkomt yn molekulêre diagnostyk is de minder-as-optimale frijlitting fan doelnukleïnesoeren yn ferliking mei fenol-chloroform-ekstraksje. Yn ekstreme gefallen kin dit ferbûn wêze mei falske negativen. In soad tiid kin besparre wurde troch siedende lysis of enzymatyske spiisfertarring fan selôffal, mar dizze metoade resulteart faak yn lege PCR-gefoelichheid fanwegen ûnfoldwaande frijlitting fan nukleïnesoeren.

Remming fan polymerase-aktiviteit tidens amplifikaasje

Yn 't algemien wurdt ynhibysje brûkt as in kontenerkonsept om alle faktoaren te beskriuwen dy't liede ta suboptimale PCR-resultaten. Yn in strikt biogemyske sin is ynhibysje beheind ta de aktiviteit fan it enzyme, d.w.s. it ferminderet of foarkomt substraat-produktkonverzje troch ynteraksje mei it aktive plak fan 'e DNA-polymerase of syn kofaktor (bygelyks Mg2+ foar Taq DNA-polymerase).
Komponinten yn it stekproef of ferskate buffers en ekstrakten dy't reagentia befetsje, kinne it enzyme direkt remme of syn kofaktoren fange (bygelyks EDTA), wêrtroch't de polymerase ynaktivearre wurdt en op syn beurt liedt ta fermindere of falsk-negative PCR-resultaten.
In protte ynteraksjes tusken reaksjekomponinten en doelwit-befettende nukleïnesoeren wurde lykwols ek oantsjutten as 'PCR-ynhibitoren'. Sadree't de yntegriteit fan 'e sel fersteurd is troch isolaasje en it nukleïnesoer frijkomt, kinne ynteraksjes tusken it stekproef en de omlizzende oplossing en fêste faze foarkomme. Bygelyks, 'scavengers' kinne ien- of dûbelstrengs DNA bine fia net-kovalente ynteraksjes en de isolaasje en suvering bemuoie troch it oantal doelen te ferminderjen dat úteinlik it PCR-reaksjefet berikt.
Yn 't algemien binne PCR-ynhibitoren oanwêzich yn 'e measte lichemsfloeistoffen en reagentia dy't brûkt wurde foar klinyske diagnostyske testen (ureum yn urine, hemoglobine en heparine yn bloed), voedingssupplementen (organyske komponinten, glykogeen, fet, Ca2+-ionen) en komponinten yn 'e omjouwing (fenolen, swiere metalen).

Mear foarkommende PCR-ynhibitoren kinne fûn wurde yn baktearjes en eukaryote sellen, net-doel-DNA, DNA-binende makromolekulen fan weefselmatrices en laboratoariumapparatuer lykas wanten en plestik. Suvering fan nukleïnesoeren tidens of nei ekstraksje is de foarkommende metoade foar it fuortheljen fan PCR-ynhibitoren.
Tsjintwurdich kinne ferskate automatisearre ekstraksjeapparatuer in protte manuele protokollen ferfange, mar 100% herstel en/of suvering fan doelen is nea berikt. Potinsjele ynhibitoren kinne noch oanwêzich wêze yn 'e suvere nukleïnesoeren of kinne al effekt hawwe. Ferskillende strategyen besteane om de ynfloed fan ynhibitoren te ferminderjen. De kar fan 'e passende polymerase kin in wichtige ynfloed hawwe op' e ynhibitoraktiviteit. Oare bewiisde metoaden om PCR-ynhibysje te ferminderjen binne it ferheegjen fan 'e polymerasekonsintraasje of it tapassen fan tafoegings lykas BSA.
Remming fan PCR-reaksjes kin oantoand wurde troch it brûken fan ynterne proseskwaliteitskontrôle (IPC).
Der moat foarsichtich soarge wurde om alle reagentia en oare oplossingen yn 'e ekstraksjekit, lykas ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, út it nukleïnezuurisolaat te ferwiderjen troch in yngeande waskstap. Ofhinklik fan har konsintraasje kinne se PCR aktivearje of remme.