Ynterferinsjefaktoaren yn PCR-reaksjes

Tidens de PCR-reaksje wurde guon ynterferearjende faktoaren faak tsjinkaam.
Fanwegen de heul hege gefoelichheid fan PCR wurdt kontaminaasje beskôge as ien fan 'e wichtichste faktoaren dy't PCR-resultaten beynfloedzje en kin falsk positive resultaten produsearje.
Like kritysk binne de ferskate boarnen dy't liede ta falsk-negative resultaten. As ien of mear essensjele dielen fan it PCR-mingsel as de amplifikaasjereaksje sels wurde ynhibeare of ynterfereard, kin de diagnostyske assay wurde hindere. Dit kin liede ta fermindere effisjinsje en sels falske negative resultaten.
Njonken remming kin ferlies fan doelnukleinsûre-yntegriteit foarkomme fanwege ferstjoer- en / of opslachbetingsten foarôfgeand oan sample-tarieding. Benammen hege temperatueren of ûnfoldwaande opslach kinne liede ta skea fan sellen en nukleïnesoeren. Sel- en weefselfixaasje en paraffine-ynbêding binne bekende oarsaken fan DNA-fragmintaasje en in oanhâldend probleem (sjoch figueren 1 en 2). Yn dizze gefallen sil sels optimale isolaasje en suvering net helpe.

figuer 1 | Effekt fan immobilisaasje op DNA-yntegriteit
Agarosegelelektroforese liet sjen dat de kwaliteit fan it DNA isolearre út paraffine-seksjes fan autopsies gâns fariearre. DNA fan ferskillende gemiddelde fragmintlengten wie oanwêzich yn 'e ekstrakten ôfhinklik fan' e fixaasjemetoade. DNA waard allinich bewarre as fêst yn natuerlike beferzen samples en yn buffered neutraal formaline. It brûken fan in sterk soere Bouin fixative of unbuffered, formic acid-befette formaline resultearre yn in signifikant ferlies fan DNA. De oerbleaune fraksje is tige fragminteare.
Links wurdt de lingte fan fragminten útdrukt yn kilobase-pearen (kbp)

figuer 2 | Ferlies fan yntegriteit fan nucleic acid doelen
(a) In 3′-5′ gap op beide stringen sil resultearje yn in brek yn it doel DNA. synteze fan DNA sil noch foarkomme op it lytse fragmint. As in primer-annealing-side lykwols ûntbrekt op it DNA-fragmint, komt allinich lineêre amplifikaasje foar. Yn de meast geunstige gefal, de fragminten meie resurate inoar, mar de opbringsten sille wêze lyts en ûnder detection nivo.
(b) Ferlies fan basen, benammen troch depurinaasje en formaasje fan thymidine dimer, liedt ta in fermindering fan it oantal H-bindingen en in fermindering fan Tm. Tidens de langwerpige opwaarming faze, de primers sille smelten fuort út de matrix DNA en sil net anneal sels ûnder minder strange omstannichheden.
(c) Neistlizzende thyminebasen foarmje in TT-dimer.
In oar mienskiplik probleem dat faak foarkomt yn molekulêre diagnostyk is de minder-as-optimale frijlitting fan doelnukleinsoeren yn ferliking mei phenol-chloroform-ekstraksje. Yn ekstreme gefallen kin dit ferbûn wurde mei falske negativen. In protte tiid kin besparre wurde troch siedende lysis of enzymatyske spiisfertarring fan selôffal, mar dizze metoade resultearret faak yn in lege PCR-sensibiliteit troch ûnfoldwaande frijlitting fan nukleïnesûr.

Ynhibysje fan polymerase-aktiviteit by amplifikaasje

Yn 't algemien wurdt remming brûkt as kontenerkonsept om alle faktoaren te beskriuwen dy't liede ta suboptimale PCR-resultaten. Yn in strikt biogemyske betsjutting is remming beheind ta de aktiviteit fan it enzyme, dat wol sizze, it ferminderet of foarkomt substraat-produktkonverzje troch ynteraksje mei de aktive side fan 'e DNA-polymerase of syn kofaktor (bgl. Mg2+ foar Taq DNA-polymerase).
Komponinten yn 'e stekproef as ferskate buffers en úttreksels dy't reagents befetsje kinne it enzyme direkt ynhiberje of syn kofaktoren (bygelyks EDTA) fange, dêrmei de polymerase ynaktivearje en op syn beurt liede ta fermindere of falske negative PCR-resultaten.
In protte ynteraksjes tusken reaksjekomponinten en nukleïnsoeren dy't nukleïnesoeren befetsje, wurde lykwols ek oanwiisd as 'PCR-ynhibitoren'. Sadree't de yntegriteit fan 'e sel wurdt fersteurd troch isolemint en de nucleic acid wurdt frijlitten, ynteraksjes tusken it stekproef en syn omlizzende oplossing en fêste faze kin foarkomme. Bygelyks kinne 'scavengers' ien- of dûbelstrenged DNA bine troch net-kovalente ynteraksjes en ynterferearje mei isolaasje en suvering troch it ferminderjen fan it oantal doelen dy't úteinlik it PCR-reaksjeskip berikke.
Yn 't algemien binne PCR-ynhibitoren oanwêzich yn' e measte lichemsfloeistoffen en reagentia dy't brûkt wurde foar klinyske diagnostyske tests (urea yn urine, hemoglobine en heparine yn bloed), fiedingssupplementen (organyske komponinten, glycogen, fet, Ca2+-ionen) en komponinten yn 'e omjouwing (fenolen) , swiere metalen)

Mear foarkommende PCR-ynhibitoren kinne fûn wurde yn baktearjes en eukaryote sellen, net-doel DNA, DNA-binende makromolekulen fan weefselmatriks en laboratoariumapparatuer lykas wanten en plestik. Suvering fan nukleïnesoeren tidens of nei ekstraksje is de foarkommende metoade foar it fuortheljen fan PCR-ynhibitoren.
Tsjintwurdich kinne ferskate automatisearre ekstraksjeapparatuer in protte hânmjittige protokollen ferfange, mar 100% herstel en / of suvering fan doelen is nea berikt. Potinsjele ynhibitoren kinne noch oanwêzich wêze yn 'e suvere nukleïnesoeren of kinne al effekt hawwe. Ferskillende strategyen besteane om de ynfloed fan ynhibitoren te ferminderjen. De kar fan it passende polymerase kin in signifikante ynfloed hawwe op inhibitoraktiviteit. Oare bewiisde metoaden om PCR-remming te ferminderjen binne it fergrutsjen fan polymerase-konsintraasje of it tapassen fan tafoegings lykas BSA.
Ynhibysje fan PCR-reaksjes kin wurde oantoand troch it brûken fan ynterne proseskwaliteitskontrôle (IPC).
Soarch moat nommen wurde om alle reagentia en oare oplossingen yn 'e ekstraksjekit, lykas ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, te ferwiderjen fan it nukleïnesûrisolaat troch in deeglike waskstap. Ofhinklik fan har konsintraasje kinne se PCR aktivearje of remme.