Ynterferinsjefaktoaren yn PCR-reaksjes

Tidens de PCR-reaksje wurde guon ynterferearende faktoaren faaks tsjinkaam.
Fanwegen de heul hege gefoelichheid fan PCR wurdt kontaminaasje beskôge as ien fan 'e wichtichste faktoaren dy't ynfloed hawwe op PCR-resultaten en kin falske positive resultaten kinne produsearje.
Lykas kritysk binne de ferskate boarnen dy't liede ta falske-negative resultaten. As ien of mear essensjele dielen fan 'e PCR-mingsel of de Amplifikaasje-reaksje sels wurde hindere of ynterferearre, kin it diagnostyske assay wurde hindere. Dit kin liede ta fermindere effisjinsje en sels falske negative resultaten.
Njonken ynhibysje, ferlies fan doelblêd kin yntiids yntegriteit foarkomme fanwege ferstjoeren fan ferstjoeren en / of opslachbetingsten foarôfgeand oan sample tarieding. Benammen, hege temperatueren as net genôch opslach liede ta skea oan skea oan sellen en nukleïske soeren. Fixaasje fan sel en weefsel en paraffine-ynbêde binne bekende oarsaken fan DNA-fragmintaasje en in oanhâldend probleem (sjoch figuer 1 en 2). Yn dizze gefallen sil sels optimale isolaasje en suvering net helpe.

Figuer 1 | Effekt fan immobilisaasje op DNA-yntegriteit
Agarosegel ElectroPhorese toant bliken dat de kwaliteit fan 'e DNA-isoleare fan Paraffin-seksjes fan autopsies ferskille oanmerklik. DNA fan ferskate gemiddelde fragmentlangen wie oanwêzich yn 'e ekstrakten ôfhinklik fan' e fixaasje-metoade. DNA waard allinich bewarre bleaun doe't fêstmakke yn Native Frozen-samples en yn buffered neutrale formaline. It brûken fan in sterk soere bouin fixative as unbufferde, formaasje soer - befette formalï, resultearre yn in signifikant ferlies fan DNA. De oerbleaune fraksje wurdt heul fragmint.
Links wurdt de lingte fan fragminten útdrukt yn kilo's-pearen (KBP)

Figuer 2 | Ferlies fan yntegriteit fan nucleic soere doelen
(a) In gap fan 3'-5 'sil oan beide strenten resultearje yn in skoft yn' e doel DNA. Synteze fan DNA sil noch foarkomme op it lytse fragmint. As in primer annabeside lykwols misse op it DNA-fragment, komt mar lineêre amplifikaasje der foar. Yn 'e meast geunstige saak kinne de fragminten inoar opnij betelje, mar de opbringsten sille lytse en ûnder detectionnivo's wêze.
(b) ferlies fan bases, fral fanwegen depurination en thymidine dimerfoarming, liedt ta in ôfname yn it oantal h-bonds en in ôfnimmende yn tm. Tidens de langwerpige warming faze sille de primers smelten fan 'e matrix DNA en sil net annaearje sels net ûnder minder streken omstannichheden.
(c) neistlizzende thymine basen foarmje in TT Dimer.
In oar mienskiplik probleem dat faak foarkomt yn molekulêre diagnostyk is de minder dan-optimale frijlitting fan doel-kearnsferwidering fergelike mei ekstraksje mei fenol-chloroform-ekstraksje. Yn ekstreme gefallen kin dit wurde assosjeare mei falske negativen. In protte tiid kin wurde bewarre troch siedende lysis of enzymatyske spiisferkear resulteart, mar dizze metoade resultearret faaks yn lege PCR-gefoelichheid fanwegen net genôch kearnsrjochten.

Ynhibysje fan polymerase-aktiviteit tidens ampiviteit

Yn 't algemien wurdt ynhibysje brûkt as kontener konsept om alle faktoaren te beskriuwen dy't liede ta suboptimale PCR-resultaten. Yn in strikt biochemyske sin is beheind ta de aktiviteit fan 'e Enzym, dat is it fermindere troch ynteraksje mei de aktive plak fan' e DNA-polymerase of syn kofaktyk (bgl. Mg2 + foar Taq Dna polymeammer).
Komponinten yn 'e stekproef as ferskate buffers en ekstrakten befetsje it enzym of syn kofaktors (yn' e omslach (bgl. EDTA) te trapjen, wêrtroch't de polymeeraasjele liedt om te ferminderjen of falske negative PCR-resultaten.
In protte ynteraksjes tusken reaksje-komponinten en doelpersoanen dy't nukleike soeren binne, wurde ek oanwiisd as 'PCR-ynhibitoaren'. Sadree't de yntegriteit fan 'e sel is fersteurd troch isolaasje en it nukleike soere, ynteraksjes tusken it stekproef en syn omlizzende oplossing en solide faze kinne foarkomme. Bygelyks, 'scavengers kinne ien of dûbele strânde DNA bine troch net-kovalente ynteraksjes en ynterferinsje mei isolaasje en suvere troch it oantal doelen te ferminderjen dy't úteinlik de PCR-reaksjeskippen berikt.
Yn 't algemien binne PCR-ynhibitoaren oanwêzich yn' e measte lichemsfloeistoffen en reaginten brûkt foar klinyske diagnostikes (urea yn urine, glyken, fet, CA2 + ioanen) en komponinten yn 'e omjouwing (fenolen, swiere metalen)

Mear precr-opheljen kin wurde fûn yn baktearjes en eukaryske sellen, net-target DNA, DNA-binende Macromolekules fan weefselmatikes en laboratoariumapparatuer lykas handschoenen en plestik. Suvering fan nukleïske soeren tidens of nei ekstraksje is de foarkar metoade foar it ferwiderjen fan PCR-hefrou.
Hjoed kin ferskate automatyske ekstraksjesapparatuer in protte hânmjittige protokollen ferfange, mar 100% herstellen en / of suvering fan doelen is nea berikt. Potinsjele ynhibitoaren kinne noch altyd oanwêzich wêze yn 'e suvere nukleïske soeren of kin al effekt hawwe nommen. Ferskillende strategyen besteane om de ynfloed fan hinderingen te ferminderjen. De kar fan 'e passende polymerie kin in wichtige ynfloed hawwe op ynhibitoraktiviteit. Oare bewiisde metoaden om PCR-ynhibysje te ferminderjen binne tanimmende polymerase konsintraasje of tapassen fan tafoegings lykas BSA.
Ynhibysje fan PCR-reaksjes kinne wurde oantoand troch it brûken fan ynterne kontrôle fan ynterne proses.
Soarch moat wurde nommen om alle reagens en oare oplossingen te ferwiderjen, lykas Ethanol, EDTA, Cetab, Cetab, SDS, ISOPROPANOL en FENOL, fan 'e nukleike soere isolearje troch in yngeande wask. Ofhinklik fan har konsintraasje kinne se PCR aktivearje of ynhibearje.